[ 摘 要] 目的: 探讨对学习记忆行为影响的机制。方法: 每天2 次给予小鼠腹腔注射不同剂量的, 连续5 天后采用行为观察和生化检测相结合的方法, 研究对小鼠学习记忆行为的影响, 包括剂量- 效应关系和时间- 效应关系以及脑内超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 和NO 含量的变化。结果: 与注射生理盐水的对照组相比, 在5 种剂量( 50 、100 、200 、400 和800 mg / kg) 中除了50 mg / kg 外, 其他4 种剂量的均能显著提高小鼠Y- 迷宫分辨学习的能力及24 h 记忆保持率, 其中400 mg / kg 剂量的****; *佳剂量的易化记忆的作用在训练后24 ~ 72 h 均显著增强( P < 0.01 ) , 以24 h *为显著; *佳剂量的可显著提高行为训练后小鼠脑内SOD 的活性( P < 0.01 ) 、降低脂质过氧化产物MDA 水平( P < 0.01 ) 以及提高NO 含量( P < 0.01 ) 。结论: 适当剂量的在一定时间内具有提高小鼠学习记忆能力的功效, 该作用可能与伴随的脑组织抗氧化能力提高和NO 含量改变有关。[ 关键词] 柴胡; 学习记忆; 超氧化物歧化酶; 丙二醛; 一氧化氮学习和记忆是神经科学研究中的一个重要领

域, 越来越多证据表明机体内过量自由基的产生与学习记忆密切相关.近年来研究发现, 柴胡对缺血再灌注引起的肝肾损伤具有保护作用, 其机制可能与抑制氧自由基形成有关, 但关于其对学习记忆的影响尚未有报道。因此, 本研究通过对柴胡小鼠学习记忆行为和脑内生化指标的观测, 初步探讨柴胡改善学习记忆的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 材料

昆明种小鼠, 雄雌各半, 体重18 ~ 22 g, 由东南大学公共卫生学院动物实验中心提供, 适应性饲养2 天后正式进入实验。( 每1 ml 含柴胡生药1 g) 为陕西西安亚宝制药厂生产, 批号20030404 ; 脑内超氧化物歧化酶( SOD) 测定试剂盒( 批号 ) 、丙二醛( MDA) 测定试剂盒( 批号) 、NO 测定试剂盒( 批号) 及考马斯亮兰蛋白测定盒( 批号 ) 均由南京建成生物工程公司提供。其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 分组及给**法

将140 只小鼠随机分成空白对照组、生理盐水对照组、50 mg / kg 柴胡组、100 mg / kg 柴胡组、200 mg / kg 柴胡组、400 mg / kg 柴胡组和800 mg / kg柴胡组。各组小鼠按各自所配浓度0.2 ml / 10g 腹腔注射, 每天2 次, 间隔8 h , 连续给药5 天, 生理盐水对照组腹腔注射等体积生理盐水。1.2.2 Y- 迷宫分辨学习的检测方法小鼠分辨学习能力的检测按文献[ 5 ] 方法进行。1 天内连续分段训练小鼠, 每10 次为一段, 两段间小鼠休息1 min , 一直训练到10 次反应中有9 次正确反应( 即90% 的正确反应率) 作为学会的标准。记录小鼠达到学会标准所需训练的次数, 次数越少, 说明学习能力越强。将给予柴胡处理的小鼠达到学会

标准所需训练的次数与正常小鼠达到学会标准所需训练的次数相比, 计算学习改善率, 反映小鼠学习能力改变的情况。间隔24 h 检测小鼠在10 次训练中的正确次数, 代表小鼠的24 h 记忆成绩。将小鼠的24 h 记忆成绩与学会的标准相比, 计算24 h 记忆保持率。同法检测小鼠的48 和72 h 记忆保持率。保持率越高, 说明动物的记忆力越好。1.2.3 小鼠脑组织SOD 活性、MDA 含量及NO 含量的测定SOD 活性测定 小鼠行为检测后, 立即断头处死, 冰上取大脑, 用生理盐水制备10% 脑组织匀浆液, 4℃离心取上清液, 用721 型分光光度计在波长550 nm 处测定其光密度值, 并按公式算出SOD 的活性。MDA 含量的测定 小鼠行为检测后, 立即断头处死, 冰上取大脑, 用生理盐水制备2 % 脑组织匀浆液, 4 ℃离心取上清液, 用721 型分光光度计在532 nm 波长处测定其光密度值, 再按公式求出MDA 生成量。NO 含量的测定 实验结束后小鼠立即断头处死, 冰上分离大脑, 去除嗅球和小脑, 用冰生理盐水冲洗血迹, 再用滤纸擦干, 电子分析天平称重, 按脑组织: 生理盐水为0.5 g ∶1 ml 比匀浆, 以3 000 r / min,4℃离心15 min , 取上清液, 冻存待测。由专业技师严

格按照操作说明进行操作。

1.3 统计学方法

用Grubb 法对实验数据的可疑值进行取舍, 数据以均数±标准差( x ±s ) 表示, 组间比较采用t 检验。P < 0.05 为差异有显著性。

2 结 果

2.1 对小鼠学习记忆影响的剂量- 效应关系Y- 迷宫行为检测结果显示, 不同剂量的对小鼠分辨学习能力和记忆保持的影响并不一致。如表1 所示, 与生理盐水对照组相比, 除50 mg / kg 剂量的组对小鼠的分辨学习能力的影响无统计学意义外, 其他4 种剂量的均显著增强小鼠的分辨学习能力( P < 0.01 ) ,

呈明显的剂量- 效应关系; 对记忆保持百分率而言,除50 mg / kg 剂量以外, 其他4 种剂的都有明显易化记忆的作用。与生理盐水对照组相比,100 ~ 800 mg / kg 的剂量都显著提高24 h 的记忆持率, 其中400 mg / kg 的****, 其记忆保持率提高34.45% 。

2.2 对小鼠记忆影响的时间- 效应关系由上述量- 效关系说明400 mg / kg 的对小鼠24 h 记忆保持的易化作用*佳。本实验进一步用该剂量观察了对小鼠Y- 迷宫分辨学习的48 及72 h 记忆保持的影响。结果表明400mg / kg 的易化记忆的作用在训练后24 ~72 h 均显著增强( P < 0.01 ) , 以24 h *为显著, 虽然48 ~ 72 h 有所下降, 但仍明显地优于该时相的生理

2.3 对小鼠脑组织SOD 活性和MDA生成的影响为探讨提高小鼠分辨学习能力, 增强记忆的脑内机制, 空白对照组、生理盐水对照组和*佳剂量( 400 mg / kg) 组的小鼠行为检测后进行脑组织SOD 活性和MDA 含量的测定。该剂量的能明显提高脑组织SOD 活性, 减少MDA 的生成( P < 0.01 ) 。

2.4 对小鼠脑组织NO 含量的影响实验发现, 400 mg / kg 能明显提高正常小鼠脑内NO 的含量( P < 0.01 )

3 讨 论

学习记忆是大脑*上等的功能, 是衡量动物发育的重要指标。国内外多采用建立条件反射的方法检测动物的行为和上等脑功能, 其中Y- 迷宫法广泛应用*为广泛。本实验结果显示: 在一定剂量范围内能明显提高小鼠在Y- 迷宫中的分辨学习能力和记忆的影响力; 其易化记忆的效应在训练后24 h *佳, 虽然48 ~ 72 h 有所下降, 但仍明显地优于该时相的生理盐水对照组, 其中*佳剂量组小鼠伴随有脑组织中SOD 活性的提高和MDA 水平的下降。SOD 是机体抗脂质过氧化酶促防御系统中的一个重要酶, 它能特异性**生物氧化产生的超氧阴离子自由基。自由基可引发脂质过氧化的链式反应, 过氧化脂质的分解终产物MDA 通过交联、结合形成脂褐素, 损伤细胞膜, 引起神经系统的功能障

碍, 在行为上表现为脑功能的衰退。因此, 本研究认为柴胡改善小鼠学习记忆功能可能与其伴有SOD 活性的提高, 从而增强SOD 终止自由基链锁反应的作用, 间接减少MDA 的产生有关, 但具体机制还需深入探讨。本实验观察到*佳剂量组的小鼠脑

组织中NO 含量与生理盐水组相比明显提高( P <0.01 ) , 提示柴胡改善学习记忆能力的作用可能与其提高脑组织中NO 的含量关系密切。目前普遍认为海马突触效应的长时程增强( LTP ) 可能是学习记忆的突触机制, NO 作为逆向信使参与LTP 的形成和维持过程。动物学习记忆过程中, 不同脑区的NO 水平增高, 本实验结果与此相符。诚然, 也有研究发现伴有空间学习障碍的小鼠海马部位的NO含量增多, NO 介导神经毒性作用, 从而损伤学习记

忆功能。笔者推测这可能与NO 具有神经毒性和神经营养的“剑样”作用有关, 当NO 含量在合理范围内波动时, 可能介导神经营养作用, 当NO 的含量过低或过高时, 则表现为神经毒性作用。综上所述, 适当剂量的在一定时间内具有提高小鼠学习记忆能力的功效, 该作用可能与其伴有脑组织抗氧化能力提高和NO 含量改变有关, 其机制值得进一步探讨